多肽合成

液相色谱是一种分离分析技术，其特点是液体作为流动相，固定相可以有多种形式，如纸张、薄板和填充床。在色谱技术的发展过程中。为了区分各种方法，根据固定相的形式，如纸色谱、薄色谱和柱液相色谱。

液相色谱仪的要求

1.流动相必须用HPLC级试剂过滤除去颗粒杂质和其他物质(用0.45μm或更薄的膜过滤)。

2.流动相过滤后应使用超声波脱气，脱气后应恢复到室温。

3.不能使用纯乙腈作为流动相，使单向阀粘住，导致泵不进液。

4.使用缓冲溶液时，样品完成后，应立即用去离子水冲洗管道和柱子一小时，然后用甲醇（或甲醇水溶液）冲洗40分钟以上，以充分冲洗离子。对于柱塞杆外部，样品完成后必须用去离子水冲洗20毫升以上。

5.如果长时间不使用仪器，应取下柱子，用堵头密封保存。注意柱子不要用纯水保存，要用有机相(如甲醇等)。)，因为纯水容易发霉。

6.每次样品完成后，应用溶解样品的溶剂清洗进样器。

7.C18柱绝对不能进入蛋白质样品、血样、生物样品。

8.堵塞导致压力过大，按预柱→混合器中的过滤器→管道过滤器→单向阀检查清洗。清洗方法:

①以异丙醇为溶剂冲洗；

②在异丙醇中间用超声波清洗；

③用10%稀硝酸清洗；

9.气泡会导致压力不稳定，重现性差，因此在使用过程中尽量避免气泡。

10.如果进液管内没有液体，则使用注射器吸液：通常在输液前清洗流动相。

11.注意柱子的pH值范围，不要注射强酸强碱样品，特别是碱性样品。

12.更换流动相时，先将吸滤头部分放入烧杯中振动边洗，再插入新的。

流动相中。更换无互溶性流动相时，用异丙醇过渡。

常见故障的确定和解决方法

(1)保留时间变化。

1.柱温变化：柱温恒定，必要时需配置恒温箱。

2.等度与梯度之间未能充分平衡：流动相平衡柱至少为10倍。

3.缓冲液容量不足：使用25mmol/L的缓冲液。

4.柱污染：每日冲洗柱。

5.柱内条件变化：稳定进样条件，调节流动相。

6.柱快达寿命：采用保护柱。

（2）缩短保留时间。

1.增加流速：检查泵，重新设置流速。

2.样品超载：减少样品量。

3.键合相流失：流动相pH值保持在3~7.5检查柱的方向。

4.流动相组成变化：防止流动相蒸发或沉淀。

5.温度增加：柱恒温。

(3)延长保留时间。

1.流速下降：管道泄漏，更换泵密封圈，排除泵内气泡。

2.硅胶柱上的活性点变化：用流动相改性剂，如加三乙胺，或用碱至钝化柱。

3.键合相流失：同前（2）3。

4.流动相组成变化：同前（2）4。

5.降温：同前（2）5。

(4)肩峰或分*

1.样品体积过大：用流量配样，总样品体积小于第一峰的15%

2.样品溶剂过强：使用较弱的样品溶剂。

3.柱坍塌或形成短路通道：更换色谱柱，腐蚀性较弱。

4.柱内烧结不锈钢失效：更换烧结不锈钢，添加在线过滤器，过滤样品。

5.进样器损坏：更换进样器转子。

(五)鬼峰

1.进样阀残余峰：每次使用后用强溶剂清洗阀门，改进阀门和样品的清洗。

2.样品中未知物：处理样品。

3.柱不平衡：重新平衡柱，用流动相作样品溶剂（特别是离子对色谱）

4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱):每日新配，使用抗氧化剂。

5.水污染（反相）：通过变化平衡时间检查水质，使用HPLC级水。

(6)基线噪声。

1.气泡(尖峰）流动相脱气：加柱背压。

2.污染(随机噪声):清洗柱，净化样品，使用HPLC级试剂。

3.检测器灯连续噪声：更换鲈灯。

4.电干扰（意外噪声）：使用稳压电源，检查干扰源（如水浴等）

5.检测器内有气泡：流动相脱气，加柱背压。

(7)峰拖尾。

1.柱超载：降低样品量，增加柱直径，采用高容量固定相。

2.峰值干扰：清洁样品，调整流动相。

3.硅羟基：

加入三乙胺，用碱性钝化柱增加缓冲液或盐浓度，降低流动相PH值，钝化样品。

4.同前(4)4同前(4)4。

5.同前(4)35.同前(4)3。

6.死体积或柱外体积过大：

尽量减少连接点，适当调整所有连接点，尽量使用细内径的连接管。

7.柱效下降：

低腐蚀条件，更换柱，使用保护柱。

(8)峰宽。

1.进样体积过大：同（4）1。

2.在进样阀中引起峰扩张L进样前后排出气泡，以减少扩散。

3.数据系统采样速度过慢：设定速率应大于每峰10点。

4.检测器时间常数过大：设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%

5.流动相粘度过高：提高柱温，采用低粘度流动相。

6.检测池体积过大：用小体积池，卸下热交换器。

7.保留时间过长：等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱。

8.柱外体积过大：尽量减小连接管径和长度。

9.样品过载：进入小浓度小体积样品。

  写到最后：

杭州固拓生物科技有限公司定制多肽合成业务：药物肽、临床肽、订书肽、淀粉肽、醛肽、环肽、二硫键搭桥多肽、穿膜肽、各种抗菌肽、美容肽、磷酸化肽、PEG肽、偶联BSA和KLH抗原肽、各类酸修饰多肽、各种胺类化合物修饰多肽（苯胺、异戊胺、二乙胺）、各类荧光标记肽（FITC、FAM系列、DOTA、TAMRA系列、Cy系列）同位素肽等。

原创文章如有转载，请注明出处“本文首发于固拓多肽合成生物科技有限公司（www.gotopbio.com）”