多肽合成

简介

瑞他鲁肽是一种胰高血糖素受体（GCGR）、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体（GIPR）和胰高血糖素样肽-1受体（GLP-IR）的三重激动剂肽，对于肥胖和由肥胖引起的二型糖尿病，心血管病、内分泌及代谢疾病等都表现出比司美格鲁肽更加优秀的临床效果，原研机构美国礼来（Eli Lilly and Company）就该药对于心血管病、二型糖尿病，以及肥胖的治疗效果的临床研究都已进入三期，在不久的将来有望成为继司美格鲁肽之后的又一突破性减肥药品，市场前景非常可观。

常见的副作用包括胃肠道症状，如恶心、呕吐和腹泻，类似于其他GLP-1类药物的副作用。在治疗初期这些症状较为常见，但随着治疗时间延长，患者通常会逐渐适应。

本方法包括以下步骤：通过Fmoc/tBu固相法合成瑞他鲁肽侧链肽树脂；脱除Lys17主链保护基Dde或Alloc，依次偶联主链保护氨基酸或保护氨基酸片段得到瑞他鲁肽肽树脂；采用酸性混合溶液对肽树脂进行裂解得到粗肽；对粗肽进行HPLC纯化、转盐、浓缩、冻干，得到瑞他鲁肽精肽。根据本发明的瑞他鲁肽合成方法，所得瑞他鲁肽产品纯度大于99 .0％，单一杂质均小于0 .10％。该合成方法操作简单，粗肽纯度高，易纯化制备，综合合成成本低，非常适于工业化生产。

瑞他鲁肽侧链肽树脂的制备

取750mmol AM Resin(取代度为0.55mmol/g),经溶胀洗涤后，将保护氨基酸Fmoc-Linker(1.5eq) 、缩合试剂DIEA(3eq)、TBTU(1.5eq)加入反应釜中，用DMF溶解，搅拌下于25~35℃条件下偶联反应120～300分钟，过滤洗涤，得Fmoc-Linker-AM  Resin。

使用20%Pip/DMF溶液脱除Fmoc保护后，加入保护氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH(3eq)和HOBt(3eq),用适量DMF溶解并冷却至0～15℃。另取DIC(3eq),搅拌下慢慢加入至保护氨 基酸DMF溶液中于0～15℃环境中搅拌反应5~15分钟,得到活化后的保护氨基酸溶液。

将活化后的保护氨基酸溶液加入到待反应的树脂中，于25~35℃条件下偶联反应120～300分钟，过滤洗涤，得Fmoc-Ser(tBu)-Linker-AM Resin。

采用上述同样方法，依次接入表2中的保护氨基酸或全保护氨基酸片段肽：Fmoc-

Pro-OH.H₂O、Fmoc-Pro-OH.H₂O、Fmoc-Pro-OH.H₂O、Fmoc-Ala-OH.H₂O、Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Ser(tBu) -OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH.H₂O、Fmoc-Gly-Gly-0H 、Fmoc-Glu(OtBu)- OH.H₂O、Fmoc-Leu-0H、Fmoc-Leu-0H、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH.H₂O、Fmoc- Ile-0H、Fmoc-Phe-0H、Fmoc-Ala-OH.H₂O、Fmoc-Gln(Trt)-Aib-0H、Fmoc-Ala-0H.H₂O、Dde- Lys(Fmoc)-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu-0tBu、二十烷二酸单叔丁脂，得Dde-Lys(AEEA-γ-Glu-(OtBu)-Eicosanedioicacid-0tBu)-Ala-Gln(Trt)-Aib-Ala-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Linker-AM Resin。

瑞他鲁肽肽树脂制备

脱除Lys¹⁷位点主链保护基Dde后再依次偶联主链各位点，使用2~3%水合肼/DMF溶  液脱除Dde保护基，于5~35℃条件下反应10min,共进行3次。对肽树脂经洗涤后，依次接入主  链各位点：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-aMeLeu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、 Boc-Tyr(tBu)-Aib-OH,得瑞他鲁肽肽树脂6500.3g。

瑞他鲁肽粗肽制备

向上述制得的瑞他鲁肽肽树脂，加入酸性混合溶液，混合溶液配比为TFA:EDT/ Tis /苯酚/H₂0=90:2.5:2.5:2.5:2.5,用量为8mL/克树脂；15～30℃搅拌反应2～4小时，得 反应混合物，利用砂芯漏斗过滤，收集滤液，再用少量TFA洗涤树脂3次，合并滤液后加入 MTBE沉淀，再用MTBE洗沉淀3次，抽干得3536.3g类白色粉末，即瑞他鲁肽粗品，粗品纯度为81.81%。

瑞他鲁肽精肽的制备

取瑞他鲁肽粗品，加水搅拌，用氨水调pH9.0~9.5至完全溶解，所得溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤；采用反相制备色谱进行纯化制备，收集瑞他鲁肽馏分；合并馏分，转钠盐，减压浓 缩，得到瑞他鲁肽水溶液；冷冻干燥，得瑞他鲁肽精肽1963.38.68g, 纯度为99.51%,最大单一杂质0.10%,总收率为55.33%,分子量为4730.76。

上述实施例表明，鲁肽精肽产品纯度大于方法也提高了最终产品得质量，工艺简单易于控制，工业化程度高

参考文献：瑞他鲁肽的合成方法及瑞他鲁肽  CN 119823233