多肽合成

卡格列肽(Cagrilintide)是一款由诺和诺德公司开发的新型长效脂化修饰胰岛淀粉素(amylin)类似物。卡格列肽由37个氨基酸组成，C末端为酰胺型，N末端的α氨基连接1个γGlu和1个二十烷二酸(C20diacid)，其氨基酸序列为C20 diacid-γGlu-KCNTATCATQRLAEFLRHSSNNFGPILPPTNVGSNTP-NH2(cycl2-7)。胰岛淀粉素通过激活位于延髓和下丘脑的特定受体，产生饱腹感，同时在非低血糖状态下抑制餐后胰高血糖素分泌，并延缓胃排空，有助于调控血糖处于稳态。司美格鲁肽<span pingfang="" sc",="" system-ui,="" -apple-system,="" blinkmacsystemfont,="" "helvetica="" neue",="" "hiragino="" sans="" gb",="" "microsoft="" yahei="" ui",="" yahei",="" arial,="" sans-serif;"="" style="outline: none; padding: 0px; margin: 0px; font-size: 15px; letter-spacing: 0.5px; color: rgba(0, 0, 0, 0.9);">的复方制剂CagriSema减重效果可达22.7%，并显示出良好的安全性和耐受性。目前卡格列肽的制备工艺报道较少，仅有1篇专利合成工艺。仅报道了采用常规固相合成方法的生产工艺。

背景技术

目前，长肽的制备方法主要采用基因重组法和化学合成法。由于基因重组法所得多肽的C末端为羧基，需通过在C末端增加一个Gly，再采用肽基甘氨酸a酰胺化单加氧酶(peptidyl-glycinealpha-amidating monooxygenase,PAM)水解Gly，以实现C末端酰胺化。因PAM成本高昂，所以C端酰胺型多肽的合成主要采用固相合成法。以往，对类似多肽的合成通常使用1-羟基苯并三唑/N,N"-二异丙基碳二亚胺作为缩合剂，而本研究拟采用爆炸风险更低、消旋化副反应更少和偶联效率更佳的2-肟氰乙酸乙酯(Oxyma)。本文以RinkAmide AM树脂为固相载体，Oxyma和DIC为缩合试剂，依次将Fmoc保护氨基酸与树脂偶联，得到卡格列肽树脂肽，经三氟乙酸裂解得到还原型卡格列肽粗品，再经过环化、分离、纯化、冻干得到高纯度卡格列肽。

该研究系统探讨和优化了相关制备工艺参数，可为卡格列肽的工业化生产提供借鉴。

中文名称：卡格列肽

英文名称：Cagrilintide

公司编号：GT-F064

CAS号：1415456-99-3

序列：C20 diacid-γGlu-KCNTATCATQRLAEFLRHSSNNFGPILPPTNVGSNTP-NH2(cycl 2-7)

分子式：C194H312N54O59S2

分子量：4409.1

1、树脂溶胀

称取取代度为0.28mmol/g的Rink Amide AM树脂1.0g(0.28mmol)，置多肽合成仪的反应器中，加入DMF 15mL，搅拌60min，使树脂充分溶胀，氮气鼓吹，除去溶液，剩余物用DMF10mL洗涤(2minx2)。

2、脱Fmoc保护基

向溶胀好的树脂加入含20% PIP的DMF溶液10mL，搅拌(15minx2)后过滤;剩余物用DMF 10mL洗涤2次，再用甲醇10mL洗涤2次，最后用DMF10mL洗涤2次。取少许树脂加入茚三酮检测试剂A 40uL和B 40uL,置沸水浴中加热5min,判断Fmoc去除程度，若树脂呈紫黑色则说明脱保护完全。

3、首个氨基酸的缩合

称取Fmoc-Pro-OH 189mg(0.56mmol,2eq)、Oxyma 120mg(0.84mmol,3eq)、DIC 106mg(0.84mol,3eq)，用DMF10mL溶解，预活化30min，投入反应器中，在氮气保护下反应，每隔1h用茚三酮显色法检测，若树脂呈现无色或淡黄色则表示反应完全，反之则需要继续反应。

4、剩余氨基酸的缩合

缩合反应结束后，过滤除去母液，树脂用DMF 10mL洗涤1次，再用甲醇10mL洗涤2次，最后用DMF 10mL洗涤2次。根据卡格列肽的序列，从C端到N端偶联氨基酸,重复“2”项和“3”项下操作，直至全部氨基酸缩合完毕。最后用DCM10mL和甲醇10mL交替洗涤3~6次，减压干燥24h，得到黄色树脂肽3 220mg。固相合成过程如下图所示。

5、树脂肽裂解与工艺优化

在酸裂解过程中，除了目标产物外，还会产生多种副产物，一般需要在裂解试剂中加入清除剂以捕获碳正离子。根据1的氨基酸组成以及合成时采 用的侧链保护基，选取PhOH、水、Tis、PhSMe、EDT、DODT等作为清除剂。其中，PhOH能捕获tBu,  也易于与氧化剂反应；水能清除tBu和Boc;Tis能还原裂解过程中的敏感基团(如二硫键); PhSMe有助于去除Trt和Pbf, 并减少Cys侧链的氧化；EDT也能够清除tBu, 并减少Cys侧链的氧化；DODT是EDT的一种替代品，具有恶臭较小的优点。

裂解方法：按表1配制各组裂解液，各200μL,  分别与树脂肽20mg在20℃反应2h, 用乙醚1.6 mL沉淀，离心(9660×g)5min;沉淀用乙醚洗涤3次，干燥后用水1mL溶解，经孔径0.22μm的水系聚醚砜滤膜过滤，用HPLC法分析。色谱条件如下：色谱柱YMCC4分析柱(4.6mm×250mm,5μm);  流动相A为0.05%TFA水溶液B为0.05%TFA乙腈溶液，梯度洗脱(0—5 min,B25%;5—25 min,B25%—65%);检测波长215nm;流速1mL/min;  柱温45℃;进样量10μL。

结果如表1所示，配方F裂解液的成分较为简单， 且裂解所得还原型的卡格列肽峰面积较大。

裂解时间优化

通常增加反应时间有利于提高收率，但过长的反 应时间也会增加副反应的发生风险，所以需要选择合 适的反应时间。选用配方F裂解液，按“2.2.1”项下裂解方法操作，在反应1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h  时分别取样检测，对裂解时间进行优化。结果如下图所示，反应2.0h时，还原型卡格列肽主峰纯度和峰面积时间/h均较高，故确定裂解时间为2.0h。

裂解温度优化

裂解温度的变化对反应的影响尤为明显，温度 较低会降低裂解效率，较高则会影响肽的稳定性，因此对裂解温度进行优化。设置如表2所示的反应温度进行裂解试验，采用配方F裂解液，裂解2.0h,   其他条件同“2.2.1”项，所得结果见表2。可见，在25℃下反应，所得卡格列肽主峰纯度和峰面积均较高。因此，后续试验的裂解温度设置为25℃。

小结

综上所述，最终优化裂解工艺如下：取干燥的树脂肽1.0g,    加入裂解液(由TFA、PhOH、DODT、Tis组成，体积比为90:2 . 5:5:2.5) 10 mL,  于25℃搅拌反应2h。反应液用砂芯漏斗过  滤，滤液加入冷乙醚(-20℃)80mL,  搅拌5min   后在-20℃静置30min, 离心，弃去上层清液，白色沉淀用乙醚洗涤3～6次，减压干燥。最终得白色固体(还原型1粗肽)325mg 。按式①计算得合成收率为38.56%。

合成收率=(实际粗肽质量×含量)/理论粗肽质量×100%① 含量=(粗肽峰面积/进样体积)/(标准品峰面积/进样体积)

本研究采用Fmoc固相合成策略，以Rink Amide AM树脂为载体，采用2倍投料比、Oxyma/DIC为缩合试剂进行固相合成，采用由TFA、PhOH、DODT、Tis( 体积比为90:2.5:5:2.5)组成的  裂解液，于25℃裂解2h后得还原型1;经碘氧化0.5h后，使用乙酸、水、乙腈组成的流动相体系、C₄-30nm制备柱进行一步反相HPLC纯化，最终以26.14%的路线总收率得到卡格列肽,HPLC纯度为98.00%。

本文主要研究了卡格列肽的制备工艺，并旨在提高反应收率、降低工艺难度，为其工业化生产提供参考。 下一步，将对自制的卡格列肽进行细胞水平和动物水平的  活性评价。此外，后续研究将采用二肽氨基酸、固相合成/液相合成混合法等合成策略，进一步探索产品的最佳合成工艺。