多肽合成

普卡那肽（Prucalopride）是一种用于治疗慢性便秘的多肽类药物，属于选择性 5 - 羟色胺 4（5-HT4）受体激动剂。其制备过程涉及多肽合成、纯化及结构修饰等步骤，以下是其核心制备方法及关键技术要点的详细解析：

一、基本化学结构与合成策略

1. 化学结构

普卡那肽的分子式为 C29H41N5O4S，相对分子质量约 541.73，结构包含：

N 端：焦谷氨酸（pGlu，环化谷氨酸）

核心肽链：Pro-Ile-Asp-Phe-NH₂（脯氨酸 - 异亮氨酸 - 天冬氨酸 - 苯丙氨酸酰胺）

特殊修饰：N 端焦谷氨酸的环化结构，需通过化学环化反应实现。

2. 合成策略

方法选择：因含环化结构，通常采用固相多肽合成法（SPPS），便于在树脂上进行环化反应，减少副产物生成。

关键步骤：

氨基酸偶联：从 C 端（苯丙氨酸酰胺）向 N 端延伸，逐步连接 Asp、Ile、Pro。

焦谷氨酸环化：N 端谷氨酸的 α- 氨基与侧链羧基环化形成五元环（焦谷氨酸结构）。

裂解与纯化：从树脂上裂解肽链，通过高效液相色谱（HPLC）纯化获得目标产物。

二、具体制备步骤与技术细节

1. 树脂选择与 C 端起始

树脂类型：选用 Rink Amide MBHA 树脂（氨基树脂），便于 C 端直接形成酰胺结构（Phe-NH₂）。

活化方式：

苯丙氨酸（Phe）通过 Fmoc（9 - 芴甲氧羰基）保护氨基，用 HATU（2-(7 - 偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'- 四甲基脲六氟磷酸盐）和 DIEA（N,N - 二异丙基乙胺）活化羧基，与树脂氨基偶联。

反应条件：室温下振荡 2 小时，用茚三酮显色法检测偶联完全性。

2. 氨基酸链延伸（Asp→Ile→Pro）

脱保护：用 20% 哌啶 / DMF 溶液脱去 Fmoc 保护基，露出 α- 氨基。

偶联反应：

天冬氨酸（Asp）需用 tBu（叔丁基）保护侧链羧基，异亮氨酸（Ile）和脯氨酸（Pro）用 Fmoc 保护氨基，依次通过 HATU/DIEA 活化偶联。

每步偶联后用乙酸酐 / 吡啶溶液封端未反应氨基，减少副产物。

3. 焦谷氨酸（pGlu）环化

环化前处理：脱去 N 端谷氨酸的 Fmoc 保护基，保留侧链羧基保护基（如 Trt，三苯甲基）。

环化反应：

使用 EDC・HCl（1 - 乙基 - 3-(3 - 二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐）和 HOBt（1 - 羟基苯并三唑）催化，在 DMF 中室温反应 12-16 小时，促使 α- 氨基与侧链羧基脱水环化形成焦谷氨酸。

关键控制：反应 pH 需维持在 4.5-5.5（用 HOAc 调节），避免过度环化或消旋化。

4. 树脂裂解与粗肽释放

裂解试剂：采用 TFA（三氟乙酸）/H₂O/TIS（三异丙基硅烷）=95:2.5:2.5（体积比）的混合液，室温下反应 2 小时，断裂肽链与树脂的连接键（如 Wang 树脂的酯键）。

沉淀与洗涤：裂解液用冷乙醚沉淀，离心后收集粗肽，用乙醚洗涤 3 次除去 TFA 等杂质。

5. 纯化与结构确证

纯化方法：

反相 HPLC：使用 C18 柱，流动相为乙腈 / 水（含 0.1% TFA）梯度洗脱，收集目标峰（保留时间需与标准品一致）。

冷冻干燥：纯化后的肽溶液经冷冻干燥得到白色粉末状成品。

结构确证：

质谱（MS）：检测分子离子峰（[M+H]+≈542.3），确认分子量。

核磁共振（NMR）：分析 ¹H-NMR 和 ¹³C-NMR 谱图，验证氨基酸序列及环化结构。

HPLC 纯度检测：要求主峰纯度≥99.0%，单一杂质≤0.1%。